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MSC无血清培养基
MSC无血清培养基
英文名称:MSC NutriStem® XF Medium 无血清培养基总访问:672
国产/进口:进口半年访问:164
产地/品牌:以色列/Biological Industries产品类别:血清/培养基
规       格:05-200-1A/B 基础培养基, 05-201-1U/06营养添加物 最后更新:2019-12-23
货       号:
CAS   号:
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销售商: 上海逍鹏生物科技有限公司 查看该公司所有产品 >>
  • 产品介绍
  • 公司简介

间充质干细胞无血清培养基

MSC NutriStem® XF Medium

产品描述:

  •  EU注册证号:DE/CA22/419-33 IVD。

  • 同时取得美国FDA DMF注册号(No:29469) ,多个单位已用于临床二、三期验证。

  • 为多种原代/传代来源的hMSC(骨髓、脂肪组织、脐带)培养特别开发。

  • 此hMSC培养体系,无血清、无异源动物成分,且能保持hMSC典型特征,在细胞治疗和组织工程中具有高品质高稳定性。 

产品说明书:
​一、目的:利用间充质干细胞无血清培养基培养分离脐带间充质干细胞。

二、材料:新生儿脐带

三、主要仪器:医用手术器械,生物安全柜,CO2培养箱,6孔培养板,T25培养瓶

四、试剂:

1 MSC NutriStem® XF Medium

用途 品牌 货号 名称 规格 保存条件
MSC培养基 BI 05-200-1A MSC无血清基础培养基 500m 4℃
BI 05-201-1U MSC无血清添加剂 3ml -20℃
细胞贴壁 BI 05-752-1F MSC贴壁试剂 1 ml 4℃
BI PLTGOLD010R 血小板裂解物 10ml -20℃
已知血小板裂解物含有大量的外泌体,用户可依照实验目的选用合适的贴壁试剂。
细胞传代 BI 03-079-1A 重组胰酶-EDTA 500ml RT
BI 03-048-1C 大豆胰酶抑制剂 20 ml -20℃
BI 02-023-1A DPBS缓冲液 500 ml RT
辅助试剂 BI 05-713-1B D10 冻存液 100 ml 4℃
BI 03-031-1B 青链双抗 100ml -20℃


五、实验前准备:

5.1完全培养基的准备

5.1.1冻存的MSC NutriStem® XF Supplement在室温或2-8℃解冻,避免反复冻融。

5.1.2配制:MSC NutriStem® XF Basal Medium(培养基):MSC NutriStem® XF Supplement(添加物):青链双抗=500ml:3ml:5ml,4℃保存,2周内使用。

注1:双抗非必须,建议原代(P0)时使用。

注2:培养基含L-Glutamine,贮藏时避免长期照光。

5.2包被培养皿

或跳过此步骤,直接加2%血小板裂解物,促进MSC细胞贴壁与生长。

5.2.1使用DPBS溶液(货号:02-023-1A),将MSC贴壁试剂稀释100倍(1:100)。

5.2.2参照表3,加入适量的1X MSC贴壁试剂涂层培养皿或板。

表3  涂层过程中贴壁试剂建议使用量

 

培养器皿

表面积cm2/孔或瓶

1X MSC贴壁试剂使用体积

96孔板

0.34

0.05~0.1 ml

24孔板

1.9

0.2~0.4 ml

12孔板

3.9

0.4~0.8 ml

6孔板/ 35 cm培养皿

9.6

1~2 ml

T25瓶/ 60 cm培养皿

25

2.5~5 ml

T75瓶

75

7.5~15 ml

注1:涂层的培养皿需在无菌条件下2℃-8℃储存,需在一周内使用。(标示红色为原厂建议使用量,经过实验测试后可减半使用)

注2:包被期间, 注意包被液不可以干掉!

3:若使用预包被培养瓶(Corning的CellBind系列,或NEST TC处理系列), 步骤5.2的包被可略过。

5.2.3轻轻摇动培养皿,确认贴壁试剂均匀分布在培养皿表面后,用封口膜包裹涂层的培养皿。

5.2.4在2-8℃孵育过夜;或者在CO2培养箱,37℃,至少孵育30分钟。

5.2.5接种前, 吸除贴壁试剂,再用DPBS轻轻冲洗培养皿,即可接种细胞。

5.3制备1X大豆胰酶抑制剂

5.3.1使用无菌的DPBS,将50X大豆胰酶抑制剂(03-048-1C)稀释成1X。

六、使用范例:

6.1 UC-MSC原代培养 (组织块法)

6.1.1无菌条件下取新鲜脐带,用DPBS漂洗净血迹

* 一般脐带取得非无菌环境,可以稍微用75%酒精润洗。

6.1.2置250px 培养皿中,剪成1~50px脐段,剔除血管,用DPBS洗净血迹,再剪成1mm3组织块。(图 1)

6.1.3用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。

6.1.4 37℃,5%CO2培养箱孵育 30min,以使组织块粘贴在培养皿壁上。

6.1.5 向每孔滴加0.8ml 完全培养基 (注意沿孔壁小心滴加,勿使冲动组织块)。

6.1.6 37℃,5% CO2 培养箱孵育过夜,次日 (D1) 每孔再补加1ml 完全培养基。

6.1.7 37℃,5% CO继续培养,5天 (D6) 后半量换液 (此时一般看不到细胞,但最快3天就可看到细胞从组织边沿爬出)。

6.1.8再过5天后半量换液 (此时一般会有细胞爬出,但最晚可到14天会出现细胞从组织边沿爬出) (图2、图3)。

6.1.9每2天换一次培养液,继续培养2~4天,待细胞融合度(Confluency)达到约80%后传代培养(图4)。

注1:组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁,换液动作要尽可能轻微,避免冲动组织块。培养基加量不能太多,以免组织块漂浮。

6.UC-MSC原代培养 (消化法)

MSC NutriStem® XF Medium也能有效地培养消化法取得的原代细胞,操做方式可依各实验室的实验步骤,或参考上海逍鹏MSC ACF Tissue Digestive Mix (货号:C35010010) 的使用说明。

6.2.1 将脐带用DPBS漂洗干净,剪成1-50px,后剔除血管。

* 一般脐带取得非无菌环境,可以稍微用75%酒精润洗。

6.2.2将组织剪成3-5mm3后,移入50ml离心管,再加入的分离液。

* 一条长度10公分的脐带建议加入10ml的分离液;或者组织块 : 分离液(vol)= 1:1。

** 视情况而定,可自行在分离液中添加1%青链双抗(BI, Cat# 03-031-1B)。

6.2.3把50ml离心管横放在37度细胞培养箱,过夜反应(16小时)。

* 若总反应体积较大,也可持续旋转混合。

6.2.4加入和分离液等体积的0.05%EDTA(BI, Cat#03-015-1B)终止反应后,1500 xg离心5分钟,去除上清。

* 溶液比较浓稠,小心不要影响下层的细胞;建议留下5ml左右的溶液。

** 若是脂肪组织,没有粘稠的情形,以常规的200-300 xg离心即可。

*** 没有EDTA, 可使用无钙镁DPBS取代;此时建议后面步骤6多重复2-3次,以确实去除酵素。

6.2.5以和分离液等体积的无钙镁DPBS重悬细胞后,500 xg离心5分钟,去除上清。

6.2.6再次以和分离液等体积的无钙镁DPBS重悬细胞后,250 xg离心5分钟,去除上清。

6.2.7用适量的培养基重悬细胞后,即可按常规细胞培养方法接种P0代细胞培养。

* 消化后的原代细胞,建议培养时接种密度提高到10,000/cm2以上;传代后即可按常规的接种密度培养。

6.3 UC-MSC传代培养与冻存

6.3.1待细胞融和度达到约80%后进行传代(细胞不能太密集,否则容易分化),吸弃传代板孔中的培养基,每孔加适量DPBS轻轻冲洗1次。

6.3.2根据培养皿适量加入重组胰酶-EDTA(货号:03-079-1A,T25建议使用1ml),在37℃,5% CO2培养箱作用3~5 min(可轻拍培养瓶帮助细胞脱落)。

6.3.3显微镜下观察细胞完全脱落后,使用5-10ml稀释大豆胰酶抑制剂(SBTI, 货号:03-048-1,1X),1000rpm离心3~5min。

6.3.4谨慎吸出上清,细胞团块用适当体积的完全培养基悬浮后,混匀细胞悬液。

6.3.5按照所需的比例进行传代或按照5000-6000cells/cm2的细胞密度将细胞接种至培养器皿中,放入37℃, 5% CO2培养箱内培养。

6.3.6每2-3天更换一次培养基,待细胞融合度达到80%左右时,参照操作步骤6.3.1~6.3.5做细胞传代;或者参照操作步骤6.3.1~6.3.3收获细胞冻存。

6.3.7细胞冻存:将细胞团块悬浮于适量 (0.5~1×106cells/ml) D10无血清 冻存液(货号:05-713-1)中,装入冻存管,2~8℃冰箱放置30min,-80℃冰箱放置 24h,转入液氮罐冻存。

:本方法仅供参考,用户可根据自身经验做合理调整。

附图:(如下是组织块法,建议客户可以尝试消化法)

 

        

 图1剔除脐带3根动静脉血管            图2细胞从组织块边沿爬出

         

图3细胞快速增殖                            图4传代时机成熟

产品官网链接:https://www.bioind.com/worldwide/nutristem-msc-medium/

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