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数字PCR技术在DNA甲基化检测中的应用
点击次数:1738 发布日期:2019-10-12  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

DNA甲基化是目前研究最多的表观遗传修饰之一,发生于CpG二核苷酸序列C5位置的胞嘧啶上,多发生于CpG岛上,研究发现,DNA甲基化参与调节多种细胞过程,包括胚胎发育,转录,X染色体失活,基因组印迹、染色体稳定性等。

许多研究发现,DNA甲基化在一系列的疾。ㄈ绨┲⒌龋┢鸬绞种匾淖饔。在癌症患者中,与正常人体相比,DNA甲基化多发生两个变化:1、启动子区域CpG岛的高甲基化,导致肿瘤抑制基因沉默;2:重复区域的低甲基化,导致基因组不稳定1,2。

图1:DNA甲基化与癌症的关系1

DNA甲基化的改变多发生于癌症早期,在某些特定癌症中,检测特异的甲基化标志物有助于癌症的早期发现,进而大大提高癌症患者的生存率。目前,美国国家癌症协会(ACS)在最近更新的结直肠癌筛查指南中建议每3年做一次多靶点粪便DNA的甲基化检测。因此,急需找到一个灵敏度高、特异性强、操作简单快捷的方法对临床样本DNA甲基化进行检测。

微液滴数字PCR (ddPCR)是近年来PCR技术的一项新进展,通过微液滴化,终点PCR和泊松分布,数字PCR无需标准曲线即可实现核酸浓度的绝对定量。与实时定量PCR技术(qPCR)对比,数字PCR具有灵敏度高,准确度高、精密度高、重复性高,对PCR抑制剂耐受度高的优势。

目前,Dawne N等人3使用数字PCR进行DNA甲基化的检测。结果显示,数字PCR方法可检出低至0.5%的SNRPN启动子甲基化,其线性R2可达到0.9903,且两次完全独立的实验重复性极强。

 

图2:ddPCR检测DNA甲基化的灵敏度、线性范围3


图3:ddPCR检测DNA甲基化的稳定性

(A、B为两次完全独立实验)3

使用ddPCR方法检测VIM基因启动子DNA甲基化,其最低灵敏度可达到0.03%,线性R2可达到0.9998。且将ddPCR结果与NGS检测结果对比,一致性强,所用DNA量更少。

Liesbeth Van Wesenbeeck等人4使用ddPCR和qPCR做DNA甲基化线性检测时,图4对比结果显示,在检测低拷贝DNA时,ddPCR准确性较qPCR更高。

图4:ddPCR(左图)与qPCR(右图)测试高拷贝

(1157拷贝/反应,上图)与低拷贝(222拷贝/反应,下图)

DNA甲基化实测值与理论值之差与理论值关系图4

综上所述,使用ddPCR方法进行DNA甲基化分析时,其灵敏度高,稳定性高,准确性高,可用于检测血浆游离DNA、FFPE DNA等多种样本来源的DNA的甲基化状态。因此,基于ddPCR的甲基化检测技术将来有潜力应用于肿瘤甲基化标志物的检测中,辅助临床诊断和治疗,应用于肿瘤早诊和筛查领域。

新羿生物专注于微液滴数字PCR全链条自主研发,包括芯片、仪器、试剂、软件等核心产品,目前已申请专利50余项,开发产品数十项。新羿生物的试剂类产品不仅可以在新羿TD-1数字PCR平台上使用,而且可以在其他商用微液滴数字PCR平台上使用,灵敏度高,特异性好,重复性高。新羿生物的微液滴数字PCR技术在检测过程中全程封闭检测,不需转移液滴,可避免交叉污染,方便、准确、灵敏。

随着人民生活水平的提高,我国结直肠癌(Colorectal Carcinoma, CRC)发病率逐年升高,现在我国发达地区CRC已经是发病率居第二位的恶性肿瘤,成为威胁我国人民健康的一种重大疾病,但是CRC发展相对缓慢,可以通过早期发现而得到根治及预防。新羿结直肠癌甲基化基因检测试剂盒采用Methyl-ddPCR技术,以CRC粪便样本DNA为检测对象,对CRC粪便样本中多个基因的甲基化状态同时进行检测,从而辅助临床早期诊断结直肠癌。

参考文献:

  1. Keith D. Robertson, “DNA methylation and human disease”. Nature Reviews: Genetics. 2005; 6: 597-610.

  2. Ernst J. Kuipers, et al. “Colorectal cancer”. Nature Reviews: Disease Primers. 2015; 1: 1-25.

  3. Dawne Shelton, et al. “AACR 2014 - Cross Validation of NGS methylated targets using ddPCR”. https://www.researchgate.net/publication/263043581.

  4. Liesbeth Van Wesenbeeck, et al. “Droplt digital PCR is an accurate method to assess methylation status on FFPE samples”. Epigenetics. 2018; 13 (3): 207–213.

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来源:新羿制造科技(北京)有限公司
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